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蛋白質的磷酸化修飾是生物體內重要的共價修飾方式之一。蛋白質的磷酸化和去磷酸化這一可逆過程幾乎調節著包括細胞的增殖、發育、分化、信號轉導、細胞凋亡、神經活動、肌肉收縮及腫瘤發生等過程在內的所有生命活動。目前已知有許多人類疾病是由于某些異常的磷酸化修飾所引起，而有些磷酸化修飾卻是某種疾病所導致的后果。在哺乳動物細胞生命周期中，大約有1/3的蛋白質發生過磷酸化修飾；在脊椎動物基因組中，有5%的基因編碼的蛋白質是參與磷酸化和去磷酸化過程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修飾本身所具有的簡單、靈活、可逆的特性以及磷酸基團的供體ATP的易得性，使得磷酸化修飾被真核細胞所選擇接受而成為一種zui普遍的調控手段。鑒于磷酸化修飾在生命活動中所具有的重要意義，探索磷酸化修飾過程的奧秘及其對細胞功能的影響已成為眾多生物化學家及蛋白組學家所關心的內容。用蛋白質組學的理念和分析方法研究蛋白質磷酸化修飾，可以從整體上觀察細胞或組織中磷酸化修飾的狀態及其變化，這對以某一種或幾種激酶及其產物為研究對象的經典分析方法是一個重要的補充，同時提供了一個全新的研究視角，并由此派生出磷酸化蛋白質組學（phosphoproteomics）這一新概念。在蛋白質組學水平進行磷酸化蛋白質的分析定量研究已引起人們廣泛關注，各種技術也相應地發展起來。
1. 磷酸化蛋白質和磷酸肽的富集
1.1 免疫親和色譜
富集磷酸化蛋白質zui簡單的方法就是用識別磷酸化氨基酸殘基的特異抗體進行免疫共沉淀，從復雜混合物中免疫沉淀出目標蛋白質。目前，僅有酪氨酸磷酸化蛋白質的單克隆抗體可以用來進行有效的免疫共沉淀。這是因為該抗體具有較強的親和力和特異性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白質。Imam-Sghiouar等人從B-淋巴細胞中通過免疫沉淀獲得酪氨酸磷酸化的蛋白質，然后再用二維電泳分離技術并結合質譜分析方法，鑒定出多個與斯科特綜合癥相關的酪氨酸磷酸化的蛋白質。由于抗磷酸化絲氨酸和蘇氨酸抗體的抗原決定簇較小，所以令抗原抗體的結合位點存在空間障礙，特異性較差。因此，目前采用磷酸化絲氨酸/蘇氨酸的抗體來富集磷酸化蛋白質的研究相對較 少。
1.2 固相金屬親和色譜（IMAC）
固相金屬親和色譜（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一項較為成熟的磷酸化多肽分離富集技術。它是利用磷酸基團與固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金屬離子的高親和力來富集磷酸肽。目前發展的高通量磷酸化蛋白質組分析途徑主要采用IMAC親和色譜-反相液相色譜-串聯質譜-數據庫檢索聯用的方法。Ficarro等人zui先將IMAC富集技術應用到細胞系大規模磷酸化蛋白質組學的分析中，并從啤酒酵母中鑒定出了216個磷酸化肽段和383個磷酸化位點。該方法的優點在于對每個可溶磷酸肽，不管其長度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脫下的樣品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丟失一些與IMAC柱結合能力較弱的磷酸肽或某些因有多個磷酸化位點而難以洗脫的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段與固相金屬離子也有結合能力，也可能被富集。為了解決IMAC柱的非特異性吸附的問題，可以采用對羧基進行酯化反應以及改變洗脫液的體系等方法來提高IMAC柱的特異性。此外，自動化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技術平臺的研究開發，使磷酸肽的富集、反相分離和質譜檢測都能自動在線進行，為IMAC在蛋白質組學中的高通量應用開辟了道路。
1.3 TiO2色譜
近期金屬氧化物親和富集技術得到了人們極大的關注。2004年，Pinkse等人將二氧化鈦（TiO2）技術引進磷酸化蛋白質組學領域，利用TiO2與磷酸肽上磷酸基團的親和能力實現對磷酸肽的相對富集，并建立了通過TiO2作為預分離的2D-NanoLCESI-MS/MS 技術平臺。雖然該技術在對磷酸化肽段富集時的選擇性和靈敏度方面都優于IMAC技術，但仍然存在非特異性吸附等問題。后來，人們又利用納米材料比表面積大的特點，對TiO2納米級材料進行了開發研究，從而進一步增強了該技術對磷酸化肽段富集的巨大潛力。但是，目前納米級的TiO2富集磷酸化肽段技術還只能適于MALDI源的質譜儀，在ESI源質譜儀中的應用還有待進一步研究。
1.4 離子交換色譜
離子交換色譜是利用物質的帶電部分與具有相反電荷的離子交換劑的相互作用不同來達到分離純化的目的。Beausoleil等人發現大部分磷酸化肽在pH 2.7的溶液中所帶凈電荷是1+，而非磷酸化肽所帶凈電荷大部分為2+，因此，利用強陽離子交換（strong cattion exchange, SCE）技術就可以將磷酸化肽與非磷酸化肽分離開來。磷酸化肽zui先被洗脫下來，實現相對富集。有人曾利用這一方法分離出了人HeLa細胞核蛋白的磷酸化肽。但該法也有不足之處，因為有一些磷酸化肽所帶電荷也是2+，甚至帶有更多的電荷，這種情況下就會造成部分磷酸化肽的丟失。
1.5 親/疏水作用色譜
磷酸肽按照其疏水性不同而采用RP-HPLC進行分離。RP-HPLC分離是減少混合肽中的復雜成分的一個十分重要的方法。該方法重現性好、簡單且不需要特別的設備。極少量的磷酸化肽也可以在低流速下用毛細管柱分離。需要注意的是，高親水性的磷酸肽可能并未被吸附在柱上而直接流過色譜柱，而高疏水性的肽則會到zui高梯度時才會被洗脫甚至可能不被洗脫，因此在樣本中有些磷酸多肽無法被檢測到。再者，磷酸多肽吸附于金屬表面上，如果使用金屬注射器則可能發生顯著的樣品丟失。盡管如此，RP-HPLC仍在磷酸多肽分析中得到廣泛的應用，這是因為它容易與質譜聯用，并且即使分析物沒有同位素標記，也可以在樣本混合物中發現和描述磷酸化肽。
1.6 磷酸基團的化學修飾
近來，有人將肽或蛋白混合物置于堿性硫代二乙醇溶液中，通過β消除從磷酸化絲氨酸或蘇氨酸中去掉磷酸基團H3PO4，形成的雙鍵受到硫代二乙醇的作用，巰基取代磷酸基團，生物素與巰基相連，被標記的肽或蛋白質上樣于固定有親和素的層析柱，通過生物素與親和素的高親和力作用而達到磷酸化肽或蛋白質富集的目的。這一方法的主要缺點在于它不能富集酪氨酸磷酸化的蛋白質和肽。Zhou等人用另外一種方法修飾磷酸化肽，用碳二亞胺濃縮反應將半胱氨酸加在磷酸基團部分，修飾過的肽段以共價鍵與碘乙酰胺樹脂結合，酸洗滌釋放。此方法既可用于富集磷酸化酪氨酸，可用于富集磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸，但需要多步化學反應和柱純化過程。化學修飾方法zui大的缺點在于整個過程需要大量蛋白，不利于低豐度蛋白的檢測。
2. 生物質譜分析磷酸化位點
用于蛋白質鑒定的質譜依電離源的不同分為兩種：基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser-desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）和電噴霧電離質譜（electrosp ray ionization mass spectrometry, ESI-MS）。前者利用基質吸收激光的能量使固相的多肽樣品離子化，后者則在噴射過程中利用電場使液相的多肽樣品離子化。離子化的肽段進入質量分析器，因質量電荷比（m/z）差異發生分離，通過測量肽段離子的相關參數，可獲得肽質量指紋圖（peptide mass fingerprint, PMF）、肽序列標簽（peptide sequence tag, PST）或部分氨基酸序列。zui后，應用適當的軟件搜尋基因組和蛋白質組數據庫，從而實現對蛋白質的定性鑒定及功能分析。
2.1 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）
MALDI-TOF-MS由于操作簡單、敏感性強、價格低廉而廣泛應用于蛋白質鑒定工作。不過，將其應用于蛋白質磷酸化研究就遇到了問題。磷酸化肽段帶負電荷，而生物質譜常用正離子模式，導致離子化程度低；大量非磷酸化肽段的信號抑制了磷酸化肽段的信號并且在肽質量指紋圖中缺少標志性離子。因而，MALDI-TOF-MS通過與堿性磷酸酶的去磷酸化作用或與氫氟酸相結合來鑒定磷酸化肽段。絲氨酸和蘇氨酸磷酸化肽段會丟失磷酸基團（-98 u），而酪氨酸磷酸化肽段會去磷酸化（-80 u）。MALDI-TOF的另一特征可以進行亞穩態裂解分析，即源后衰變（post source decay, PSD）。前離子從離子源內解析電離過程中獲得的內能在無場漂移區內飛行過程中通過發生斷裂而釋放其能量，這個過程稱為源后衰變。由此得到的碎片離子與前離子有相同的飛行速度但能量不同，在反射器內穿越的深度不一，可被反射器按其質量大小（即能量大小）從小到大依次反射，并到達檢測器檢測。
2.2 串聯質譜（MS/MS）
生物質譜的質量分析器有不同的選擇，如三級四級桿、離子阱、飛行時間、傅立葉回旋共振等質量分析器。將兩個質譜儀的質量分析器串聯，*個質量分析器將預測組分與其它組分分離，第二個質量分析器對其進行掃描，產生該組分的質譜圖即為串連質譜。利用三級四級桿、四級桿-飛行時間、四級桿-離子阱進行前體離子掃描或中性丟失掃描，可鑒定磷酸化位點。
前體離子掃描是利用絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化肽段在碰撞誘導解離（CID）時會發生磷酸基團丟失的原理來實施檢測的。這些丟失的磷酸基團可以作為磷酸肽的“報告離子”：在陰離子模式下，*個四級桿用來進行全譜掃描，CID在第二個四級桿中進行，第三個四級桿只選擇通過質荷比為79的離子（即PO3-，m/z 79），用來鑒定磷酸化肽段。一旦磷酸化肽段被鑒定出來后，質譜便轉為陽離子掃描模式，進行肽段的測序。前體離子掃描的另一種方式是直接進行陽離子掃描，immonium離子（m/z 216.04）是酪氨酸磷酸化肽段的特征性碎片離子。而絲氨酸、蘇氨酸磷酸化肽段涉及到對殘基上的磷酸基團進行化學修飾。在脫磷酸基團和發生β消除反應后，加入合成的巰基季銨進行加成反應，然后在低能量的CID下，產生特異的小分子碎片（m/z 122.06）。
中性丟失掃描在質譜檢測磷酸化位點中也有重要地位。在陽離子掃描模式下，絲氨酸、蘇氨酸磷酸化肽段會失去H3PO4或HPO3，從而質量數會減少98u或80 u。中性丟失掃描的優點是*可以在陽離子模式下操作，而不像前體離子掃描那樣要變換離子掃描方式，并且此方法在離子阱分析器中也有很好的利用。因為質譜檢測到的是質量電荷比而不是質量本身，所以中性丟失掃描時檢測到的信號可能有幾個數值。例如，在失去H3PO4的情況下，若離子帶單電荷，則檢測到98 u，若帶雙電荷或三電荷，則會相應檢測到49.0 u和32.7 u；在CID時發生β消除反應時，失去的有可能是H3PO4（98 u）也有可能是HPO3（80 u），從而使分析復雜化。
2.3 傅里葉變換離子回旋共振質譜（FT-ICR MS）
傅里葉離子回旋共振（Fourier transform ion cyclotron resonance, FT-ICR）質譜儀是一種相對較新的質譜儀，具有相當高的分辨率和準確性，是幾乎現有的生物質譜儀中功能zui強大的一種。FT-ICR的碎片模式是電子俘獲分裂，其原理是照射一束亞熱態的電子到電噴霧所產生的磷酸化肽段或者小分子蛋白本身，使其形成碎片。zui重要的是磷酸基團在電子俘獲分析（electron cap ture dissociation, ECD）中被保留在碎片分子中，使得直接判斷磷酸化位點成為可能。FT-ICR的分辨率*，是其它生物質譜的10倍。因而，對于小分子蛋白可以不用酶解而可以直接分析其磷酸化狀態。這項技術zui大的缺點在于，必須是較純的樣品才能進行ECD分析，而且儀器的價格較為昂貴，對操作人員的技術要求也較高。
2.4 液質聯用（LC-MS）
色譜的優勢在于分離，為混合物的分離提供了zui有效的選擇，但其難以得到物質的結構信息，主要依靠與標準物對比來判斷未知物，對無紫外吸收化合物的檢測還要通過其它途徑進行分析。質譜能夠提供物質的結構信息，用樣量也非常少，但其分析的樣品需要進行純化，具有一定的純度之后才可以直接進行分析。因此，人們期望將色譜與質譜聯合使用以彌補這兩種儀器各自的缺點。采用LC-MS結合SEQUEST運算法則，就可以進一步降低樣品的復雜性，從而能夠對低豐度磷酸化蛋白質進行鑒定。
3. 定量磷酸化蛋白質組學技術
3.1 雙向凝膠電泳
雙向凝膠電泳結合質譜分析仍然是分離和鑒定蛋白質的主要手段。二維電泳（2-DE）根據蛋白質的分子量、等電點、可溶性及相對豐度來分離蛋白。2-DE結合敏感銀染方法已成功分離和鑒定了TGF-β和MAPK信號轉導通路中的大量分子。該方法首先使用泛抗磷酸化絲/蘇氨酸抗體或（和）泛抗磷酸化酪氨酸抗體，富集細胞被刺激前后的絲/蘇氨酸或（和）酪氨酸磷酸化蛋白分子，進行2-DE分離；然后比較刺激前后的圖譜以獲取差異蛋白質點；隨后再用質譜技術進行鑒定，zui終獲得刺激因子介導的信號轉導通路中信號分子的磷酸化改變，即信號分子是否活化。
在上述基礎上發展起來的更加敏感且能進行定量分析凝膠蛋白質點的新方法叫做熒光差異雙向凝膠電泳（fluorescent two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D DIGE）。它采用熒光試劑來標記蛋白質并通過熒光成像來獲取電泳圖像。其優點是可以在同一塊凝膠上比較兩種處理不同或來源不同的蛋白質組表達，能夠比較地在較寬的動態范圍內使對研究者感興趣的蛋白質進行定量，特別對包括有多組別和多個生物學重復情況的研究具有其*的優勢。
3.2 熒光染料Pro-Q Diamond dye染色
32P放射性標記（32P-labeling）可以非常靈敏、直觀地檢測磷酸化蛋白。早在1991年，該技術便在研究磷酸化蛋白質的定量分析中表現出了一定的應用前景。但32P高放射性對細胞造成損害并對磷酸化狀態有影響，此外還存在不能標記組織樣本，有放射性污染等問題。熒光染料染色（Pro-Q Diamond）是MolecularProbes公司前幾年推出的一種磷酸化蛋白質的熒光染料，它可以直接對聚丙烯酰胺凝膠中的磷酸化蛋白質進行選擇性染色，無需同位素或特異性抗體，只有通過熒光掃描儀檢測就可以直接顯示出一維或二維凝膠電泳膠上分離的磷酸化蛋白質，對非磷酸化蛋白質的反應性很低，熒光強度會隨著蛋白質磷酸化程度的不同而呈現出一定的變化。這種染料與質譜兼容，膠上的蛋白質點可以通過膠上酶切進行質譜鑒定。Chen等人將32P放射性標記和Pro-Q染色兩種方法結合起來分析中國鼠卵巢細胞的磷酸化蛋白質組。結果發現，在定量磷酸化蛋白質時，結果受標記時間的影響，而且放射性標記的磷酸化蛋白質與Pro-Q磷酸化染料所染出的磷酸化蛋白質之間相關性較差。Hopper等人分別用2DE-Pro-QDiamond染料方法和32P放射性標記方法分析了豬心線粒體中的磷酸化蛋白質組，也同樣發現二者相關性較差的問題。進一步研究發現，32P標記比Pro-Q Diamond方法更靈敏，特別是能更好地檢測那些磷酸基團轉化速率高的蛋白質。但是，Pro-Q Diamond對豐度較高但磷酸基團轉化速率較低的蛋白質具有更高的靈敏度。然而對于不同的磷酸化位點，Pro-Q Diamond的靈敏度也并非一成不變。
3.3 穩定同位素標記
2000年，Weckwerth、Willmitzer和Fiehn等人提出穩定同位素標記（stable-isotope labeling, SIL）與LC/MS結合使用來進行蛋白質定量，從而開辟了定量蛋白質組學的一個新技術平臺。與傳統的定量方法（如2-DE）相比，穩定同位素標記技術在定量準確度和規模化定量分析方面都有很大的應用前景。在磷酸化蛋白質差異定量研究中，目前常用以下幾種穩定同位素標記定量方法。
3.3.1 18O標記技術
18O標記技術是將蛋白質酶切時或酶切后放入H218O中，在蛋白酶催化作用下將羧基上的兩個氧替換成18O而進行的。除了C端肽之外，在適宜的條件下，所有的肽段一般都可以替換上兩個18O，使肽段質量數相差4 u。Korbel等人[29]采取免疫沉淀反應/IDE/LC/MS與18O標記來分析EPO受體依賴的蛋白質，鑒定并定量了187個磷酸化蛋白，發現89個蛋白質上的酪氨酸以EPO受體依賴的方式發生變化。18O標記技術是一種操作簡單、條件溫和、應用廣泛（trypsin、chymotrypsin、lys-C和glu-C都能被用來標記酶切肽段的C端），并且沒有副產物的標記技術。它能與多種磷酸化肽段富集方法連用，適于低豐度磷酸化肽段的定量標記。目前，18O標記技術已得到上一些大型實驗室的青睞。但是，用18O進行同位素標記經常產生標記一個氧原子和兩個氧原子不等的現象，即產生分子質量+2和+4兩種混合的產物。此外，18O與16O 交換速率也依肽段的大小、氨基酸的類型、酶的類型以及肽段序列而有所變化。所以，盡管該技術已經得到比較普遍的應用，但是要得到準確的定量結果還需對其進一步優化。
3.3.2 同位素代謝標記技術
15N標記法（15N labeling）是Oda等人zui早提出的一種同位素代謝標記技術，它是在培養基中分別摻入14N和15N來尋找差異表達蛋白的一種方法。雖然該方法非常適用于追蹤單個磷酸化位點的動力學變化，但它于分析那些表達水平相對較高的蛋白質。
SILAC（stable isotope labeling by amino acid in cellculture）技術[25]出現以后，很快取代了15N標記法。SILAC技術，即細胞培養過程中氨基酸的穩定同位素標記，具有顯著的優點（表2），因而迅速獲得認可并在實驗室中廣泛使用。已經使用過的穩定同位素標記氨基酸有精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）和亮氨酸（Leu）等。
3.3.3 化學標記技術
目前，化學標記技術發展的基本化學原理主要有針對肽段上磷酸基團的β消除-馬氏加成反應和在羧基端的酯化反應以及氨基端的酰化反應。其中，β消除-馬氏加成反應用得，其基本原理是使磷酸化肽段的磷酸基團在堿性環境下發生β消除形成雙鍵，同時用標有不同同位素的親核試劑與雙鍵發生加成反應以取代磷酸基團。該技術是專門針對磷酸化肽段而建立的，但較多的化學修飾以及純化步驟，造成了大量樣本的損失，而且在沒有預分離和處理的情況下，該反應對O-糖基化肽段也起反應，所以在結果中將導致兩種類型肽段的混淆。Thompson等人將IMAC技術與β消除-馬氏加成反應結合來分析定量磷酸化蛋白質。他們首先用IMAC親和富集磷酸化肽段，然后用堿性溶液令磷酸化肽段發生β消除，與此同時磷酸化肽段也被洗脫下來，接著進行馬氏加成反應從而標記上含有不同同位素的標簽。 各種各樣的化學修飾技術為磷酸化蛋白質的定量帶來了可喜的前景，但這些化學修飾方法本身固有的反應效率、副產物等問題以及在大規模磷酸化蛋白質定量研究中的應用還有待進一步研究。
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