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本文轉載自“藥明康德”。
在癌癥免疫療法領域，免疫檢查點抑制劑和CAR-T療法無疑是改變癌癥治療模式的兩大突破。然而，免疫檢查點抑制劑已經可以用于治療多種癌癥類型，而CAR-T療法的適應癥卻。CAR-T療法雖然在治療B細胞血液癌癥方面表現出的療效，然而治療其它類型癌癥的CAR-T療法還遲遲未能誕生。
究其根源，CAR-T療法的設計和開發需要克服三大挑戰：缺少理想的腫瘤抗原作為靶點，腫瘤介導的免疫抑制，和CAR-T療法的嚴重毒副作用。那么，用什么方法可以克服這三大挑戰，提高CAR-T療法的效果并拓寬其應用范圍呢？
日前，麻省理工學院（MIT）跨界學者盧冠達（Timothy Lu）博士在《Nature Reviews Cancer》上發表文章，介紹了使用合成生物學構建新一代“智能”CAR-T療法的進展。80后的盧冠達博士是MIT電子工程、計算機科學和生物工程系教授，也是Senti Biosciences、Tango Therapeutics和Synlogic等多家生物技術公司的創始人。今天，藥明康德微信團隊將和讀者一起分享這篇文章中的精彩內容。
使用基因回路讓兩種抗原控制CAR-T細胞的激活
CAR-T細胞療法首先從患者體內收集T細胞，然后通過基因工程在T細胞表面表達嵌合抗原受體（CAR）。這是一種融合蛋白，它的細胞外蛋白域是一個識別腫瘤表面抗原的單鏈可變區片段（scFv），而細胞內蛋白域包含了T細胞受體（TCR）和相關共刺激受體的細胞內蛋白域。這些CAR-T細胞然后被輸回患者體內，它們可以識別和消滅表達抗原的腫瘤細胞。
目前，已有兩種CAR-T療法獲得FDA批準，它們在治療B細胞血癌方面療效突出。然而，目前獲批的CAR-T療法都只能識別一種抗原。發現一個能夠特異性標記腫瘤細胞的腫瘤表面抗原是一個巨大的挑戰，這也是限制CAR-T療法廣泛應用的原因之一。
例如，靶向CD19的CAR-T細胞能夠有效治療B細胞血癌，然而因為CD19也表達在正常B細胞表面，這類療法也會消滅正常B細胞，從而導致B細胞發育不全。雖然靶向CD19的CAR-T療法的這一副作用通常不會致命，而且可以通過靜脈輸入免疫球蛋白來進行治療，然而，在靶向其它抗原時，患者可能無法耐受CAR-T細胞對正常細胞的殺傷。
合成化學力圖使用工程學的理論來改造活細胞，通過在細胞中加入基因電路（gene circuits），讓它們能夠感知外來信號并且作出簡單的邏輯決策。比如，在設計新一代CAR-T細胞方面，依靠多種抗原來區分腫瘤細胞和正常細胞，將可以讓CAR-T更為靶向腫瘤，并且更具有適應性。
▲傳統CAR設計（a）和基于synNotch的CAR-T細胞設計（b），synNotch受體讓CAR-T細胞需要同時與抗原A和B結合才能被激活 (圖片來源：參考資料[1]）
例如，合成生物學可以設計出一種T細胞，它必須識別腫瘤表面表達的兩種抗原才會被激活。這一設計可以通過人工合成的Notch受體（synNotch）來實現。synNotch受體在與腫瘤表面的特定抗原A結合后，通過釋放轉錄因子，能夠激發CAR-T細胞表達靶向第二個抗原B的CAR。在這種情況下，CAR-T細胞只有在接觸到抗原A，再接觸到抗原B的時候才會被激活。
這一synNotch技術初由加州大學舊金山分校的Wendell Lim博士率領的團隊開發，并且在動物實驗中得到驗證。Lim博士共同創建了名為Cell Design Labs的公司來轉化這一技術。在2017年12月，吉利德科學旗下的Kite Pharmaceuticals公司以可高達5.67億美元的數額收購了Cell Design Labs，將這一技術納入該公司的CAR-T開發平臺。
▲保護正常細胞不受CAR-T攻擊的CAR-T設計策略，正常細胞表面表達的抗原B會激活iCAR，從而抑制CAR-T細胞的激活（圖片來源：參考資料[1]）
而在位于紐約的紀念斯隆-凱特琳癌癥中心（MSKCC），Michel Sadelain博士領導的團隊設計出了同樣依靠兩種不同抗原的另一類CAR-T療法。這一設計利用在正常細胞表面表達的抗原，抑制CAR-T細胞的功能。在這種設計中，CAR-T細胞表面表達著兩種不同的CAR，一種是激活性CAR，它與腫瘤表面表達的特定抗原A的結合能夠激活T細胞。而另一種是抑制性CAR（iCAR），它將靶向正常細胞表面表達的抗原B的抗體與免疫檢查點蛋白CTLA-4或PD-1受體的細胞內域融合在一起。這種iCAR在與抗原結合后能夠抑制T細胞的激活。當表達兩種CAR的T細胞同時接觸到兩種抗原時，抑制性CAR會抑制激活性CAR的作用。所以，這種CAR-T細胞只有在接觸到腫瘤特異性抗原A，但是不接觸到正常細胞中表達的自體抗原B時才會被激活。
▲雙特異性CAR-T細胞設計，兩種不同的scFv片段可以識別腫瘤表面兩種不同的抗原，任何一種都可以激活CAR-T細胞（圖片來源：參考資料[1]）
接受CAR-T療法治療的腫瘤會通過降低靶向抗原的表達來逃避CAR-T細胞的攻擊。例如，很大一部分接受抗CD19 CAR-T細胞療法的患者出現癌癥復發的原因是腫瘤細胞丟失了CD19抗原的表達。因此，設計能夠識別在腫瘤細胞上表達的多種抗原的CAR-T系統可能讓CAR-T細胞的功能更為全面，防止因為抗原丟失導致的癌癥復發。
通過注入兩種靶向不同腫瘤抗原的CAR-T療法，或者在同一T細胞上表達兩種不同CAR，可以實現同時識別腫瘤上的兩種抗原。而新的研究方向是在一個CAR的細胞外蛋白域中納入兩個靶向不同抗原的scFvs，生成一個雙特異性CAR。例如，靶向CD19和CD20的雙特異性CAR已經在動物試驗中防止CD19陰性的腫瘤復發。而靶向CD19和CD22的雙特異性CAR-T療法也表現出良好的臨床前活性。
使用藥物調控CAR-T細胞的活性
目前，在將CAR-T細胞輸回患者體內后，如何調控免疫反應的強度是一個難題。例如，與CAR-T療法相關的嚴重副作用包括細胞因子釋放綜合征和神經毒性。這些毒副作用產生的原因是，將CAR-T細胞輸回患者體內后，我們缺乏有效的手段來控制CAR-T細胞的增殖、活性和在體內的分布。
▲利用小分子藥物激活胱天蛋白酶9，導致CAR-T細胞凋亡的”安全開關“（圖片來源：Bellicum Pharmaceuticals公司）
為了更地控制CAR-T細胞的數量和活性，研究人員已經開發出能夠促發CAR-T細胞“zi殺”的安全開關。以Bellicum Pharmaceuticals公司開發的CaspaCIDe技術為例，研究人員在CAR-T細胞中加入了一個能夠被名為rimiducid的小分子藥物激活的胱天蛋白酶9（Caspase 9）融合蛋白。激活胱天蛋白酶9能夠導致CAR-T細胞發生細胞凋亡，從而終止過度的CAR-T細胞活性。這一安全系統已經被納入該公司的主打通用型T細胞產品rivogenlecleucel中。在人體試驗中，它能夠在注入藥物30分鐘之內就啟動細胞凋亡。
▲GoCAR-T技術讓CAR-T細胞只有在小分子藥物存在時才會被激活（圖片來源：Bellicum公司）
而另一種通過藥物來對CAR-T細胞活性進行微調的設計方式是，讓CAR的初狀態處于未激活狀態，只有在抗原和其它調控藥物存在的情況下才能夠被激活。Bellicum公司的GoCAR-T技術讓CAR的共刺激受體部分受到rimiducid的調控，只有在CAR-T細胞與腫瘤抗原蛋白接觸，并且接受rimiducid治療時，CAR-T細胞才能夠被激活。該公司目前將這一技術用于治療實體瘤的CAR-T產品BPX-601中，目前它已經進入臨床期開發，在1/2期臨床試驗中接受檢驗。
▲用小分子藥物連接分成兩半的CAR，激活CAR-T細胞（圖片來源：參考資料[6]）
而上面提到過的UCSF的Wendell Lim博士的研究團隊采用另外一種設計用藥物激活CAR-T細胞活性。他們將傳統的嵌合抗原受體分為兩個部分，只有在這兩個部分被藥物連接起來后，CAR才能夠激活下游信號通路，引起免疫反應。
克服腫瘤免疫抑制微環境的障礙
CAR-T療法治療實體瘤需要克服的一個重要挑戰是腫瘤微環境介導的免疫抑制。它可能抑制T細胞的運輸和激活，導致雖然CAR-T細胞能夠識別腫瘤抗原，但是仍然不能夠有效行使它的免疫功能。解決這一挑戰的策略之一是為CAR-T細胞武裝上新的“武器”，例如讓它們表達免疫刺激因子IL-12，IL-15或者CD40L。
例如，MSKCC的Renier J. Brentjens博士率領的研究團隊通過讓CAR-T細胞持續表達IL-12，在動物試驗中讓這些“武裝”起來的CAR-T細胞能夠克服腫瘤微環境的抑制作用。這一團隊還設計出表達抗PD-1抗體的CAR-T細胞，消除免疫檢查點蛋白對CAR-T細胞的抑制。
▲synNotch控制的表達系統可用來在腫瘤附近表達治療性蛋白（圖片來源：參考資料[7]）
然而，讓CAR-T細胞持續表達IL-12等促炎癥細胞因子可能帶來全身性的毒副作用，因為在全身血循環中流動的CAR-T細胞可以不斷釋放IL-12。為了對IL-12的釋放進行調控，UCSF的Wendell Lim博士設計出了使用synNotch控制的治療系統，通過synNotch來在腫瘤微環境中特異性釋放IL-12等細胞因子，或者其它治療性蛋白。這些手段都可以納入CAR-T細胞的設計中，進一步增強CAR-T細胞克服腫瘤微環境的能力。
結語
合成生物學已經可以通過為CAR-T療法增添基因回路，擴展療法的可控性和適應能力。我們仍然需要更多的試驗來證明這些新設計在臨床情況下的效果和安全性。盧冠達博士在綜述中同時指出，這些基因回路的復雜性意味著，將它們導入細胞并且整合入基因組將成為研發過程的瓶頸。我們需要更精簡的基因回路設計和更有效的遞送載體。
合成生物學在癌癥治療方面的應用仍然處于初級階段，我們期待更多的基礎科學、轉化科學和臨床研究讓基于基因回路的細胞療法在臨床醫藥開發方面展現它的威力。
參考資料：
[1] Wu et al., (2019). Engineering advanced cancer therapies with synthetic biology. Nature Reviews Cancer,
[2] A suicide switch for CAR-T? Retrieved April 15, 2019,
[3] Bellicum Pharmaceuticals. Retrieved April 15, 2019,
[4] Cellectis. Retrieved April 15, 2019,
[5] Controlling CAR-T: How scientists plan to make the engineered T cell therapy safer, and work for more cancers. Retrieved April 15, 2019,
[6] Wu et al., (2015). Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science, doi: 10.1126/science.aab4077
[7] Roybal et al., (2016). Engineering T Cells with Customized Therapeutic Response Programs Using Synthetic Notch Receptors. Cell,
13916499749
