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腫瘤抑制蛋白p53是一種序列特異性轉錄因子，通過抑制或激活下游的靶基因來調節細胞增殖和凋亡。功能性p53的缺乏導致致瘤性轉化， p53基因的突變也是目前人惡性腫瘤中常見的基因變異之一， 40多年來一直是腫瘤研究領域中重要和活躍的分子之一。近幾年來，科學家們對p53的異形體越來越多。迄今為止，人們已鑒定出14種天然的p53異形體（isoform）：p53α、p53β、p53γ、Δ40p53α、Δ40p53β、Δ40p53γ、Δ133p53α、Δ133p53β、Δ133p53γ、Δ160p53α、Δ160p53β、Δ160p53γ、Δp53和 p53ψ，而且其中的很多p53異形體能夠導致不同的生物學表型。
盡管野生型全長p53的功能已得到很好的確定，但是各種p53異形體在衰老、生長率和凋亡中的生理作用以一種復雜的經常明顯存在沖突的方式關聯在一起。美國喬治城大學醫學中心細胞重編程實驗室主任、細胞永生化科學家，病理學系劉學鋒（Xuefeng Liu）教授及其同事們之前已在體內和體外證實兩種p53異形體---Δ133p53α和p53β---潛在地調節人細胞的增殖并可能調節細胞重編程。
在一項發表在Nature子刊（細胞死亡和疾病）的研究[1]中，劉學鋒教授及其團隊報道了一種以前未有見過報道的有關Δ133p53α新功能----調節條件性細胞重編程過程和端粒酶的活性。利用他們在2011年開發出的條件性重編程細胞（conditional reprogramming cell， CRC）技術對兩種在體外培養時具有有限增殖壽命（replicative lifespan）的原代人細胞---從新生兒包皮中分離出的人包皮角化細胞（human foreskin keratinocyte， HFK）和從正常的成年人前列腺組織中分離出的人前列腺上皮細胞（human prostate epithelial cell， HPEC）---進行條件性重編程，結果證實Δ133p53α在這些條件性重編程的HFK和HPEC細胞中調節細胞增殖。過度表達Δ133p53α一致性地延緩細胞衰老并且讓原代培養的HFK和HPEC細胞在一種Rho相關激酶（ROCK）抑制劑的存在下能夠在體外無限地增殖（如圖1所示）。這種Δ133p53α延長的細胞增殖壽命涉及上調hTERT表達和它的端粒酶活性。
圖1，圖片來自Cell Death & Disease， Published online： 03 July 2018， doi：10.1038/s41419-018-0767-7.
鑒于這種CRC技術發揮的重要作用，那么到底什么是CRC技術呢？讓我們先回顧一下這個領域的研究背景。
在此之前，絕大多數癌細胞系是利用高分級或轉移性腫瘤建立的，而且其中的不少癌細胞系經證實與其來源的腫瘤存在遺傳上的不同。大多數原代細胞系具有有限的增殖次數，終都因細胞衰老而具有有限的壽命。迄今為止，科學家們利用了多種方法來維持原代細胞的增殖能力。
一種可能是為常見的維持方法是利用病毒癌基因轉化原代細胞。特別地，利用SV40大T抗原或致癌性人乳頭瘤病毒E6/E7蛋白的編碼基因加以轉化能夠導致很多類型的細胞永生化。但是，這種基因操縱導致基因組不穩定，因此在經過幾次傳代后，體外培養的轉化細胞漸進性地積累著基因組變異，這就會導致它們具有不同于它們起源的原代細胞的表型，比如可能具有異常的p53和Rb調節通路。
另一種永生化方法讓一些原代細胞表達人端粒酶逆轉錄酶亞基（hTERT）等外源性細胞基因就能夠阻止它們的染色體變短，讓它們逃避細胞衰老，從而導致永生化。盡管過度表達hTERT并不會導致正常的細胞發生癌變，但是所形成的細胞在經過多次傳代后也表現出異常的細胞特性。
此外，通過導入外源性基因讓皮膚細胞或血細胞等體細胞退回到一種類似于胚胎干細胞的狀態，所形成的細胞被稱作誘導性多能干細胞（iPS細胞）。這種ips細胞技術也能夠延長細胞壽命，但是它的效率相對較低，而且導入外源性基因會誘導細胞基因組發生變化，甚至可能誘發腫瘤產生。
針對現有技術的這些缺點，2010年，劉學鋒教授等人發現在體外利用ROCK抑制劑Y-27632處理三種人原代角化細胞---人新生兒包皮角化細胞、成年人陰道角化細胞和成年人子宮頸外角化細胞（ectocervical keratinocyte）---能夠極大地增加這些在體外培養時具有有限壽命的人原代角化細胞的增殖能力，地導致它們永生化[2]。更重要的是，這些永生化細胞表現出典型的原代角化細胞特征，而且它們具有正常的二倍體核型和完整的DNA損傷反應，此外還能夠經分化后產生復層上皮（stratified epithelium）。這有助于研究很多不同的皮膚上皮和黏膜上皮疾病的致病過程。
在此基礎上，劉學鋒教授等人在2011年底發現組合使用ROCK抑制劑Y-27632和經過照射的小鼠成纖維細胞（作為飼養細胞層）可誘導來自人體很多組織（比如前列腺和乳腺）的正常上皮細胞和腫瘤上皮細胞在體外無限地增殖，而無需導入外源性的病毒基因或細胞基因[3]，如圖2所示。在這種生長條件下，在5至6天內可從針刺活組織中培養出2 × 106個細胞，能夠從低溫保存的組織中培養出大量的細胞，而且還能夠利用不到4個活細胞培養出大量的細胞。持續的細胞增殖依賴于飼養細胞和Y-27632，因此將這種組合使用產生的細胞稱為條件性重編程細胞（conditionally reprogrammed cell， CRC）。此外，這些CRC細胞保持正常的二倍體核型，而且沒有致癌性。這種CRC技術也適用于來自人類和嚙齒類動物的腫瘤上皮細胞。
圖2，圖片來自The American Journal of Pathology， February 2012， doi：10.1016/j.ajpath.2011.10.036.
也正是這種CRC技術具有以上優點，它一經問世就引發人們的極大關注，并被*不少實驗室采用。基于此，劉學鋒教授等人在2017年將這種CRC技術的詳細步驟發布在Nature Protocols期刊[4]上，供人們參考。
談了這么多，那么CRC方法的作用機制什么呢？或者說，在這種方法中，作為飼養細胞的小鼠成纖維細胞和Y-27632到底起著什么作用呢？
針對這一點，美國耶魯大學醫學院的Seema Agarwal和David L. Rimm在一篇評論文章中進行了總結[5]。在這種CRC方法中，經過照射而沒有增殖能力的成纖維細胞誘導和維持原代上皮細胞表達hTERT。這種影響很可能是通過細胞間的直接相互作用或者通過分泌可擴散的生長因子和細胞因子（比如IL-6、HGF和TGFβ等）加以實現的。它也可能是通過提供一種不可溶的胞外基質（ECM）或者通過分泌ECM重塑蛋白（比如MMP-9和MMP-3）加以調節的。
經過照射的非增殖性成纖維細胞分泌的生長因子、細胞因子和ECM重塑蛋白的不確定性組合似乎在維持與飼養細胞和Y-27632一起培養的原代上皮細胞的不受限制的增殖潛力中起著至關重要的作用。此外，另一個潛在地影響這種無限制增殖的變量是將小鼠成纖維細胞用作飼養細胞的事實。盡管這些小鼠成纖維細胞分泌的蛋白因子可能與人細胞產生的蛋白因子是相類似的，但非人細胞微環境對人原代上皮細胞的影響仍未得到充分理解。
這種CRC方法的另一個關鍵部分是使用一種ROCK抑制劑來協助維持原代上皮細胞的未分化狀態和增殖狀態。盡管這種ROCK抑制劑的使用不是新的，但是它與飼養細胞的組合使用似乎在阻止這些體外培養的細胞衰老方面起著關鍵性的作用。
為了驗證這一點，劉學鋒教授等人[3]通過對起源自正常的前列腺和乳腺組織的上皮細胞進行核型分析，證實它們仍然保持二倍體核型，而且當被注射到小鼠體內時，它們也不會產生腫瘤。因此，劉學鋒教授等人[3]證實組合使用經過照射的小鼠成纖維細胞和這種ROCK抑制劑是它們的初期存活和無限制增殖所*的。移除兩種組分中的任何一種都會導致所形成的CRC細胞分化，并終導致細胞衰老。
利用CRC技術實現的成體哺乳動物非角化細胞上皮細胞無限增殖也為基因療法、細胞療法、再生醫療和個性化醫療提供令人激動的機會。
比如，2012年，劉學鋒教授等人利用CRC方法產生源自一名患者的正常肺部組織和肺部腫瘤組織的細胞培養物[6]，其中這名患者患上20年的復發性呼吸道乳頭瘤病，并且具有進行性的雙側腫瘤浸潤肺實質。分析結果表明喉部腫瘤細胞含有一個長7.9kb的野生型人乳頭瘤病毒11型（HPV-11）基因組，而肺部腫瘤細胞含有一個長10.4kb的HPV-11基因組。 肺部腫瘤細胞中的病毒基因組的大小增加是由于它的啟動子和致癌基因區域發生復制。化學敏感性測試鑒定出伏立諾他（vorinostat）是一種潛在的治療藥物。在開始治療3個月后，這名患者的腫瘤大小保持穩定，而且在15個月時，這種效果仍是持續性的。
圖3. CRC方法及其應用，圖片來自Nature Protocols， 2017， doi：10.1038/nprot.2016.174。
總之，這種CRC方法具有快速地產生患者來源的原代細胞的巨大潛力，所產生的原代細胞可用于多種用途，包括構建活的生物庫，探究基本腫瘤生物學特性，藥物靶標識別和藥物發現等，如圖3所示。特別值得一提的是，今年4月美國國立衛生研究院（NIH）將CRC技術列為兩種重要的人源癌癥細胞模型之一 （7），作為接近患者的癌癥生物學／醫學／個體化治療和新藥發現工具之一， NCI執行所長James Doroshow是該項目的倡議和發起人。
參考文獻：
1. Abdul M. Mondal， Hua Zhou， Izumi Horikawa et al. Δ133p53α， a natural p53 isoform， contributes to conditional reprogramming and long-term proliferation of primary epithelial cells. Cell Death & Disease， Published online： 03 July 2018， doi：10.1038/s41419-018-0767-7.
2. Sandra Chapman， Xuefeng Liu， Craig Meyers et al. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation， July 2010， 120(7)：2619-2626， doi：10.1172/JCI42297.
3. Xuefeng Liu， VirginieOry， Sandra Chapman et al. ROCK Inhibitor and Feeder Cells Induce the Conditional Reprogramming of Epithelial Cells. The American Journal of Pathology， February 2012， 180(2)：599-607， doi：10.1016/j.ajpath.2011.10.036.
4. Xuefeng Liu， Ewa Krawczyk， Frank A Suprynowicz et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols， 2017， 12(2)：439–451， doi：10.1038/nprot.2016.174.
5. Seema Agarwal， David L. Rimm. Making Every Cell Like HeLa： A Giant Step For Cell Culture. The American Journal of Pathology， February 2012， 180(2)：443-445， doi：10.1016/j.ajpath.2011.12.001.
6. Hang Yuan， Scott Myers， Jingang Wang et al. Use of Reprogrammed Cells to Identify Therapy for Respiratory Papillomatosis.New England Journal of Medicine， 27 September 2012， 367(13)：1220-1227， doi：10.1056/NEJMoa1203055.
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